1987年，参加韩国“乐天选美大赛”，正式进入演艺圈。1995年，参演《像犀牛角那般一个人走吧》。1998年，李美妍与郑雨盛、朴新阳参演了由朴吉永执导的情色片《仙人掌旅馆》。1999年，参演悬疑片《女高怪谈之死亡教室》，获得第36届韩国电影大钟奖最佳女配奖。2000年，参演《错爱双鱼座》，获得第21届韩国电影青龙奖最佳女主角。2001年，第一次出演古装剧《明成皇后》，获得韩国国家电视台最佳女演员奖。同年，李美妍与李正宰主演了由裴昶浩执导的影片《黑水仙》，扮演20来岁到60多岁的孙智慧，该剧描写了隐藏在连锁杀人案件背后的历史悲剧和爱情。2002年，李美妍与李秉宪参演《中毒》，获得韩国影视最高奖项“大钟奖”最佳女主角奖。2005年，李美妍与张东健、李政宰参演《台风》，讲述了身为海盗的张东健本想带着家人进入韩国，但却遭到拒绝，于是产生复仇心理。2007年，李美妍与李泰兰参演《肩膀背后的恋人》，该剧讲述了李美妍、李泰兰饰演的两个女主演之间的爱情和对性的理解。同年，与尹继尚、金恩珠参演了由孙正炫执导的影片《为爱疯狂》。2010年，参演以朝鲜时代为背景的古装剧《巨商金万德》，该剧讲述了在济州岛以自己全部财产救助岛民，将地位高责任重这一理念完全实践于生活的女性金万德的故事。2012年，李美妍四年后首次回归大银幕，与苏志燮参演动作片《上班族》，出演杀手的女人，讲述了任职“杀手公司”的杀手为了所爱之人金盆洗手后成为其他杀手追杀目标的故事。2016年2月17日与刘亚仁合作的电影《请点赞》在韩国上映。
