1996年，参演首部电影《谈情说爱》夺得大学生电影节艺术特别奖；1997年，与伊能静主演电影《我血我情》，提名百花奖最佳男演员。1998年凭借《上海纪事》再次获得金鸡奖最佳男主角提名。1999年，与韩国演员金喜善拍摄过电影版《飞天舞》。2000年之后，王亚楠开始接拍电视剧。2002年领衔主演吴子牛导演的古装电视剧《天下粮仓》，饰演米河。2004年，参演中韩合资电视剧《飞天舞》，饰演因爱成恨、因大义而为朋友牺牲的贵族子弟南宫俊光，凭《飞天舞》角逐艾美奖，是首位角逐艾美奖的中国男演员，并参加2005年的戛纳电视节。2005年，主演连奕名执导的电视剧《野火春风斗古城》，出演男一号“杨晓冬” 。2007年，与盖丽丽主演电视剧《杀出绝地》，饰演男一号李铁杆。2010年，主演的新四军抗日题材电视剧《激战江南》播出，饰演新四军情报科长秦天刚；同年，在电影《辛亥革命》中出演袁定克一角。2012年，主演电视剧《特务生涯》。2013年12月，在高希希执导的史诗电视剧《毛泽东》中饰演叶挺。2014年，参演《我爱男闺蜜》饰演吴建瓴。
